二、傾斜培養(yǎng)基接種法（操作） 傾斜接種時無菌操作（1)接種滅菌（2)打開衛(wèi)生棉條（3)噴嘴滅菌（4)取菌苔（5)接種（6)固定棉塞測試程序（斜面接種法）） 左手握住菌株試管（葡萄球菌或大腸桿菌）和傾斜的培養(yǎng)基右手。分別用右手的小指和手掌、小指和無名指分別拔出兩個試管的棉塞，用火焰對試管口進(jìn)行消毒。使用接種環(huán)或接種器針頭伸入應(yīng)變管內(nèi)，挑取接種 伸入斜面培養(yǎng)管內(nèi)，先從斜面的底部拖一條接種線到頂部，然后從下往上曲折。完成后，使用火焰對培養(yǎng)管進(jìn)行消毒或ifice，然后在上面放一個棉塞。 37℃培養(yǎng)。 3. 半固體培養(yǎng)基接種法/穿刺接種法（操作） 穿刺接種法（穿刺接種法）的實(shí)驗(yàn)步驟 握住菌株管（大腸桿菌或志賀氏菌）和半固體培養(yǎng)管左手，右手握住接種針。用右手的小指、手掌、小指和無名指分別拔出兩根管子的棉塞，用火焰對管口消毒數(shù)次。用接種針將接種針插入菌株管中，挑出菌苔進(jìn)行接種。將半固體的中心垂直刺入管底，然后沿穿刺線退出。將其放回棉塞中，再次對接種針進(jìn)行消毒。接種后，37℃培養(yǎng)18-24小時，觀察生長情況。四、液體培養(yǎng)基接種法（操作） 實(shí)驗(yàn)步驟（液體培養(yǎng)基接種法） 用滅菌接種環(huán)挑取菌苔進(jìn)行接種。輕輕研磨，使細(xì)菌均勻分布在液體培養(yǎng)基中。

5。細(xì)菌在液體、固體和半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象（示教） 在半固體培養(yǎng)基中示教固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌毛皮和菌落樣品：沉淀均勻、渾??濁。對照樣品：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、β鏈球菌、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則。如果接觸到病原菌，一定要堅(jiān)持無菌操作，穿上白大褂。如有吸入菌液、割傷手指等意外，老師必須報(bào)告已經(jīng)接觸過菌液的吸管、載玻片等設(shè)備，放入裝有2~3% Lysol的容器中實(shí)驗(yàn)完成后，組織桌面微生物實(shí)驗(yàn)。做完實(shí)驗(yàn)后要求認(rèn)真填寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并將結(jié)果記錄在浙大實(shí)驗(yàn)報(bào)告中： 實(shí)驗(yàn)日期、年份、目的和要求（必填） 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填） 操作主要設(shè)備方法及實(shí)驗(yàn)步驟、細(xì)菌接種實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1. 革蘭氏染色（操作） 2. 細(xì)菌接種平板劃痕法（操作） 傾斜培養(yǎng)基接種法（操作） 半固體培養(yǎng)基接種法/穿刺接種法（操作） 液體培養(yǎng)基接種法 方法（操作） 細(xì)菌在液體、固體和半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象（教學(xué)） 顯微鏡的使用和保護(hù)---原理 油鏡與其他物鏡的區(qū)別在于載玻片和物鏡不是隔著一層空氣，而是隔著一層油的叫油浸系統(tǒng)。

這種油通常由雪松油制成。如果載玻片和物鏡之間的介質(zhì)是空氣，則稱為干式系統(tǒng)。光線通過載玻片時發(fā)生折射和散射，進(jìn)入物鏡的光線明顯減少?？s小視場的照度 雪松油的折射率為n=1.515，與玻璃的折射率n=1.52相似。當(dāng)光線通過載玻片時，它可以通過雪松油直接進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。油浸物鏡介質(zhì)：空氣；杉木油鏡的鑒別油鏡的鏡筒最長，鏡筒直徑最小。對于100x或Oil等油性鏡頭的使用，首先按照從低倍到高倍的操作步驟找到物像，將觀察部分移動到視野中心。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤使大功率鏡向一側(cè)移動，在蓋玻片上滴一滴雪松油，然后將油鏡對準(zhǔn)燈孔，使油鏡下端接觸雪松油（注意操作要慢，以免壓碎玻璃）。膜或損壞鏡頭）。從目鏡觀察，輕輕上下轉(zhuǎn)動微調(diào)器，直到視野中出現(xiàn)清晰的物體圖像。油鏡使用后，油鏡上的雪松油必須用蘸少許二甲苯的鏡片紙擦去，二甲苯必須用干的鏡片紙巾擦掉。顯微鏡使用后，升起鏡頭，取出載玻片標(biāo)本，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤，使每個物鏡不與光孔對準(zhǔn)液體培養(yǎng)方法，然后降低鏡筒，使物鏡靠近載物臺，降低聚光鏡，最后放回柜子里。 革蘭氏染色法由丹麥的 C. Gram 于 1884 年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中非常重要的鑒別染色方法。通過這種染色方法，可以將細(xì)菌鑒定為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）。 ) 兩種細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)革蘭氏染色法-原理 G+細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量低，乙醇不易滲透。

同時乙醇使細(xì)胞壁脫水形成屏障，阻止結(jié)晶紫-碘絡(luò)合物從細(xì)胞中滲出，因此細(xì)菌在初次染色時仍保持紫色。 G-菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較松散，肽聚糖層很薄，外膜含有大量脂類，易被乙醇溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，導(dǎo)致結(jié)晶紫-碘絡(luò)合物用乙醇溶解脫色。 ，所以細(xì)菌復(fù)染時采用紅革蘭染色法。初染：加入結(jié)晶紫溶液，染色1分鐘，用水洗滌。媒染劑：滴加盧戈氏碘溶液，作用1分鐘后，用水洗滌。脫色：在涂片上加入95%酒精2~3滴，頻繁搖晃3~5秒，斜握載玻片讓??酒精流出；然后滴加酒精，重復(fù)此動作2~3次，直到流下來的酒精無色或略呈淡紫色，大約需要半分鐘左右，直到變成淡紫色。水洗復(fù)染：加入稀石炭酸品紅1/2~1分鐘，水洗，待干，油鏡觀察。結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，不易被酒精脫色，仍保持紫色，稱為革蘭氏陽性菌。容易被酒精脫色然后復(fù)染成紅色的細(xì)菌稱為革蘭氏陰性菌。染色性、形態(tài)、排列）、繪制革蘭氏染色的意義 細(xì)菌鑒定：鑒定G+、G-、初篩標(biāo)本、藥物選擇、大部分致病物質(zhì)？ G+外毒素、G-內(nèi)毒素 細(xì)菌材料玻片標(biāo)本制備涂片- -----干燥------固定涂片：先取一個生理鹽水接種環(huán)置于玻片一端，盛放菌液左手試管，右手接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中挑取少量大腸桿菌或葡萄球菌培養(yǎng)液與生理鹽水混合，涂于涂片約1厘米直徑。涂片應(yīng)薄而均勻。

干燥：涂片最好放在室溫下自然干燥。固定：握住載玻片一端，試樣朝上，在火焰外層來回傳遞3次，約2～3秒。將載玻片背面接觸皮膚，以免感覺過熱。待涼后染色。拔、塞試管蓋時掌握無菌操作，試管口用火焰微燒；接種環(huán)使用前后，滅菌固定的目的①？殺死微生物并修復(fù)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)②？確保菌體能牢固地附著在載玻片上，以免在洗滌過程中被水沖走。細(xì)菌生長繁殖的條件 充足的養(yǎng)分 水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子 適宜的外部環(huán)境溫度 pH 氣體滲透壓 培養(yǎng)基類型1.按培養(yǎng)基成分劃分（1)@ >合成培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基的各種成分都是已知的化學(xué)物質(zhì)，這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清晰，成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，但價格相對較高，微生物生長緩慢培養(yǎng)基中。如高氏1號合成培養(yǎng)基、查氏()培養(yǎng)基等。后者是用來培養(yǎng)細(xì)菌的，這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不穩(wěn)定，很難確定，但是容易制備，營養(yǎng)豐富，所以經(jīng)常使用。（3)半-合成培養(yǎng)基。

在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入已知成分的無機(jī)鹽，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一些天然成分，如培養(yǎng)霉菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物的營養(yǎng)需求。 2.根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，固體培養(yǎng)基分為（1)固體培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入凝固劑液體培養(yǎng)方法，如瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基是常用于微生物的分離、鑒定和計(jì)數(shù)（2)液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中不添加混凝劑。該培養(yǎng)基成分均勻，微生物可以充分接觸和利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，適用于生理研究，由于發(fā)酵速度高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。（3)半固態(tài)培養(yǎng)基。加入少量對液體培養(yǎng)基的促凝劑，可用于觀察細(xì)菌的生長、運(yùn)動、菌種鑒定、噬菌體滴度測定等3.根據(jù)培養(yǎng)基用途分：（1)@ >富集培養(yǎng)基，就是在培養(yǎng)基中加入血液、血清、動植物組織進(jìn)行提取act 用于培養(yǎng)某些要求更高的微生物。 （2)選擇性培養(yǎng)基。它是根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ承┪锢砗突瘜W(xué)抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)基可用于從混合微生物中分離出所需微生物。（ 3)鑒別培養(yǎng)基。就是在培養(yǎng)基中加入一定的試劑或化學(xué)物質(zhì)，使培養(yǎng)后產(chǎn)生一定的物質(zhì)。有各種變化來區(qū)分不同種類的微生物。一、平板劃線法（操作）平板劃線法是一種分離培養(yǎng)法，接種培養(yǎng)單菌落的實(shí)驗(yàn)程序（平板劃線法）不要說話，嚴(yán)格無菌操作，燒完后冷卻接種圈。取一圈葡萄球菌或大腸桿菌劃線時手腕用力，不要將接種環(huán)嵌入瓊脂中。分散細(xì)菌