的宿主細胞。

本發明還提供了該基因編碼過氧化氫熒光探針在檢測H2O2中的應用，包括在大腸桿菌中的應用和在哺乳動物細胞中的應用。

編碼本發明的氧化氫熒光探針的核苷酸序列選自Seq ID NO 7所示的HyPer-N337T、Y131F、S262R、Seq ID NO 9所示的HyPer-N337T、Y131F、Y271N、Seq ID NO 11 m*- S262R、Y271N、Y131F、N337T、13m*-N337T、Y131F、S262R、Seq ID NO 15、Y131F、Y271N、Seq ID NO 17-N337T、Y131F、S262R、Y271N。

本發明中用于表達H202的熒光蛋白序列可以來源于維多利亞多管發光水母的熒光蛋白( )及其衍生物，主要是指環狀重排黃色熒光蛋白(cpYFP)，如SEQ ID NO: 5.

本發明提供的表達載體，其包含與表達控制序列可操作連接的本發明核酸序列。表達控制序列可以是復制起點、啟動子、增強子、操縱子、終止子、核糖體結合位點等。

本發明提供的熒光探針或融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

一個。將本發明的表達載體轉移到宿主細胞中，

灣。在適合宿主細胞表達的條件下培養宿主細胞，和

C.通過所述宿主細胞分離所述熒光探針或融合蛋白。

本發明還提供了所述熒光探針在檢測過氧化氫中的應用。在一個實施例中，本發明提供了熒光探針在檢測活細菌中H 202 中的應用。在一個實施方案中，本發明提供了熒光探針在亞細胞水平檢測H 2 O 2 中的用途。

發明詳述

一、定義：

當給出一個值或范圍時，本文所用的術語“約”是指該值或范圍在給定值或范圍的20％以內、10％以內和5％以內。

如本文所用的術語“包含”、“包含”及其等同物包括“包含”和“由...組成”的含義，例如“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包含其他物質，例如X +Y。

在本發明中，術語“HyPer”是指已報道的基因編碼過氧化氫熒光探針，是將cpYFP蛋白插入OxyR-RD中，并在中間連接一條短氨基酸鏈。

如本文所用，術語“HyPer蛋白突變體”或“HyPer突變體”或“合理設計的HyPer突變體”是指分別在HyPer探針的cpYFP元件上的相應位點引入突變位點，繼續在突變體中引入熒光增強，直到獲得具有最高熒光強度的突變體。本發明涉及的“HyPer突變體”可以包含SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18的氨基酸序列。

本發明的S262R是將第262位的氨基酸“S”改為“R”，Y271N是將第271位的氨基酸“Y”改為“N”，Y131F是將第271位的氨基酸“Y”改為“N”。第131位“Y”突變為“F”，N337T是將第337位的氨基酸“N”突變為“T”。

本發明對HyPer過氧化氫熒光探針做了很多突變體，篩選出可以在活菌、亞細胞水平檢測H2O2，探針特異性好，部分熒光強度更強的探針進行了專利申請，該探針克服了由于探針的熒光強度較弱，限制了對細胞內 H2O2 準確檢測的問題。

[0052] 如本文所用，術語“GFP”是指綠色熒光蛋白，其最初是從維多利亞水母中提取的，由238個氨基酸組成，分子量約為26kDa。GFP由12條β折疊鏈組成，形成獨特的桶狀結構過氧化氫檢測方法，被發色團三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)包裹。在氧氣存在下自發形成對羥基）。亞芐基咪唑啉酮的發色團結構產生熒光。GFP不需要輔因子產生熒光，熒光非常穩定，是一種很好的成像工具。GFP有兩個激發峰，在395nm的主峰可以產生508nm的發射光，當肩峰的激發光為475nm時產生503nm的發射光。

本文使用的術語“cpFP”是指環狀重排的熒光蛋白，該蛋白最早來源于綠色熒光蛋白GFP過氧化氫檢測方法，其氨基酸序列與GFP同源性高達90%以上。它通過一條柔韌的短肽鏈連接GFP原有的N端和C端，并在野生型GFP發色團附近的位置（如Y144和N145氨??基酸）產生新的N端和C端）。氨基酸 145-238 用作新蛋白質的 N 端，原始氨基酸 1-144 用作新蛋白質的 C 端。兩個片段由5-9條柔性短肽鏈連接，如GGSGG等，形成對空間變化敏感的環狀排列的黃色熒光蛋白cpGFP（SEQ ID NO5)）。

本文所用術語“熒光動態變化”或“熒光變化”或“熒光變化倍數”是指熒光蛋白探針結合配體后熒光強度的變化，該熒光變化可根據熒光蛋白蛋白質探針。針的光譜特性分為單通道變化或雙通道變化。具有單通道熒光變化的探針，如基于cpBFP、cpGFP、cpTFP和cpRFP的探針，當這些探針與配體結合時，其發射熒光強度會增加或減少，這種增加或減少的倍數可以稱為“熒光變化”。如果熒光探針蛋白是基于cpYFP的，它可能有兩個激發峰。當探針與配體結合時，其發射光在不同激發光下的熒光強度可能會增加或減少。比率變化，也稱為“熒光變化”，是通過除以 的熒光變化獲得的。熒光變化越大，探針的性能越好，越有可能用于細胞內檢測。

[0055] 如本文所用，術語“實時檢測”或“時空特異性檢測”是指熒光蛋白探針可以實時跟蹤細胞內特定空間的事實。當將含有具有特定定位信號的熒光蛋白探針的質粒引入細胞時，它可以表達并駐留在細胞的特定區域。在熒光顯微鏡等觀察方法下對細胞進行連續成像，將獲得的圖像轉化為細胞內的配體信號，從而在空間和時間上特異性地檢測細胞內的檢測對象。

[0056] 本發明中使用的術語“變體”、“突變體”或“衍生突變體”包括與多肽或蛋白質具有相同功能但序列不同的變體。這些變體包括（但不限于）： 多肽或蛋白質1-10序列中一個或多個（通常為1-30，優選1-20，更優選1-30）的缺失、插入和/或替換，最佳1-5)個氨基酸，并且在其羧基末端和/或氨基末端添加一個或多個(通常在20個以內，優選在10個以內，更優選5個)a)獲得的氨基酸序列。例如，在本領域中，用具有相似或相似性質的氨基酸進行取代通常不會改變多肽或蛋白質的功能。在藝術上，具有相似性質的氨基酸通常是指具有相似側鏈的氨基酸家族，這在本領域已經明確定義。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸（例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側鏈的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有側鏈的不帶電荷的極性氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺） 、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非極性側鏈的氨基酸（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、具有β支鏈側鏈的氨基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和帶有芳香側鏈的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。

如本文所用，術語“功能片段”、“衍生物”、“突變體”和“類似物”是指保留與通過本發明的合理突變產生的“HyPer突變體”基本上相同的生物學功能或活性的那些。蛋白質。通過本發明的合理突變產生的“HyPer突變體”的功能片段、衍生物、突變體或類似物可以(i)具有一個或多個保守或非保守氨基酸殘基(優選保守氨基酸殘基)取代的蛋白質。根據本文的教導，這些功能片段、衍生物和類似物為本領域技術人員所熟知。

[0058] 通過合理突變產生的類似物和“HyPer突變體”之間的差異可以是氨基酸序列的差異，或不影響序列的修飾形式的差異，或兩者。這些蛋白質包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變體可以通過多種技術獲得，例如通過輻射或暴露于誘變劑的隨機誘變，以及通過定點誘變或其他已知的分子生物學技術。

[0059] 本發明中使用的術語“核酸”可以是DNA或RNA的形式。DNA 形式包括 cDNA、基因組 DNA 或合成 DNA。DNA可以是單鏈或雙鏈的。如本文所用，關于核酸的術語“變體”可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的變體。這些核苷酸變體包括簡并變體、替換變體、缺失變體和插入變體。如本領域已知的，等位基因變體是核酸的替代形式，其可以是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但基本上不改變其編碼的蛋白質的功能。本發明的核酸可以包含與核酸序列至少約70%的序列同一性，

[0060] 本發明的熒光探針或融合蛋白或其片段的全長序列通常可以通過PCR擴增法、重組法或人工合成法獲得。對于PCR擴增方法，可以根據本發明公開的相關核苷酸序列，特別是開放閱讀框序列設計引物，可以使用市售的cDNA文庫或通過本領域技術人員已知的常規方法制備的cDNA。該文庫用作擴增相關序列的模板。當序列較長時，往往需要進行兩次或多次 PCR 擴增，然后每次擴增