使用說明：

1.樣品檢測準備：

一個。細胞或組織樣品的制備

對于培養的細胞，先將細胞收集到離心管中，棄去上清液，每100萬個細胞加入100-200微升過氧化氫檢測裂解液，然后將裂解液加入到裂解液中，充分勻漿至破壞和裂解細胞。4℃離心約3-5分鐘，取上清液進行后續測定。以每 5-10 mg 組織 100-200 微升裂解緩沖液的比例將組織樣品均質化。4°C 離心約 3-5 分鐘，取上清液用于后續檢測。上述所有操作都需要在 4°C 或冰上進行。如果不立即進行檢測，制備好的細胞或組織樣本可以在 -20°C 下冷凍。

灣。培養細胞上清液樣品的制備

培養細胞的上清液可直接用于后續檢測。

C。血清、血漿或尿液樣本的制備：

準備 50 mM 磷酸鹽緩沖液，pH 6.0。用 50 mM 磷酸鹽緩沖液 pH 6.0 將樣品稀釋 50 倍。例如，將 4 微升樣品稀釋到 196 微升 50 mM 磷酸鹽緩沖液 pH 6.0 中。稀釋后可用于后續檢測。

2.標準曲線分析的準備：

一個。過氧化氫標準品的校準：

由于過氧化氫不是很穩定，使用前需要測量過氧化氫的實際濃度進行校準。將濃度為約1M的過氧化氫用水稀釋100倍，使過氧化氫的濃度為約10mM，測定A240。A240 可以通過以下任何一種方法確定：

(a) 普通紫外分光光度計法：用紫外分光光度計配比色皿架、2000C、One?等儀器，配以石英比色皿。確定比色皿的光路（路徑），一般為1cm。用比色皿檢測的過氧化氫濃度最接近實際濃度。

(b) 微量紫外分光光度計法：如2000、一號，儀器含超微量檢測板μDrop Plate。確定光路：對于2000、一等過氧化氫檢測方法，需要取消“自動光路”，此時光路一般為0.1cm；超微檢測板μDrop Plate的光路一般為0.@ >05cm。微型紫外分光光度計的具體光程長度請參考儀器參數。

(c) 96孔紫外酶標儀法（必須能檢測240nm波長）：根據96孔板的參數確定光路。一般來說，200微升樣品的光路是0.552cm（樣品體積除以96孔）單孔內的橫截面積）。一般推薦使用專用的96孔UV檢測板（如96孔UV板）。如果沒有紫外檢測板，也可以使用一般的96孔板，但由于是非紫外檢測板，會有很高的紫外吸收信號。，所以需要設置一孔等量的雙蒸水作為空白對照（一般這類96孔板中200μl水的A240約為3.8），計算時必須減去空白對照。

注：以上方法均需設置等體積的雙蒸水作為空白對照，計算時減去該空白對照。

濃度計算公式：c=A/(ε×b)。其中：c為樣品濃度（單位為mol/L或M）；A為吸光度值；ε為波長相關的摩爾消光系數（單位為L×mol-1×cm-1或M-1×cm-1)，雙氧水的摩爾消光系數為43.6M- 1cm-1；b=光程（單位為cm）。

因此：過氧化氫濃度(M)=A240/(43.6×b)；即：過氧化氫濃度(mM)=22.94 X A240/b

從而計算出試劑盒提供的過氧化氫的實際濃度，并根據實測濃度設置后續的標準曲線。

例：將本試劑盒提供的1M左右的雙氧水用雙蒸水稀釋100倍后，使用96孔酶標儀和普通96孔板進行檢測，每孔200微升，每組平行3條。雙蒸水對照組平均A240為3.750，雙氧水樣品組平均A240為3.974，差異為0.224， 200 μl 樣品 0.552cm。代入公式，過氧化氫濃度（mM）=22.94×0.224/0.552=9.31，則為本試劑盒提供的實際過氧化氫濃度為 0.931M。

灣。標準曲線的設置：

樣品在什么溶液中，標準也應該在什么溶液中稀釋，以減少錯誤。例如，對于細胞樣品，標準品應該用過氧化氫檢測裂解液稀釋，對于培養細胞的上清樣品，標準品應該用相應的細胞培養液稀釋。標準溶液可稀釋至 1、3、10、30、100 μmol/L，或 1、2、5、1 0、20、50、100 μmol/L。初步測定后，可獲知樣品的濃度范圍，可在樣品濃度范圍附近對標樣進行集中測定。

3.過氧化氫濃度的測定：

一個。在冰上或冰水浴中融化過氧化氫檢測試劑。

灣。向檢測孔或檢測管中加入 50 微升樣品或標準品。

C。在每個孔中加入 100 微升過氧化氫檢測試劑。

d。輕輕搖晃或輕敲以混合，然后在室溫 (15-30°C) 下放置 30 分鐘。然后立即確定 A560。如果測量 A560 有困難，波長可以選擇 540-570nm。

e. 根據標準曲線計算樣品中過氧化氫的濃度。

注意：如果樣品中過氧化氫濃度過高，可適當稀釋后再測定。如果樣品中過氧化氫的濃度過低，可以將樣品的體積改為100微升過氧化氫檢測方法，而標準品也使用100微升，檢測試劑仍使用100微升。這樣可以提高檢測的靈敏度，但缺點是樣品需要消耗100微升。